Revista Agro. Vol 3, N°1. (enero 2025 - diciembre 2025)
Soto, N. Suarez, M. Castro L. Implementación de la técnica de
producción de embriones in vitro en ovinos en Costa Rica.
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Implementación de la técnica de
producción de embriones in vitro en
ovinos en Costa Rica
Implementation of the in vitro embryo
production technique in sheep in Costa
Rica
Implementação da técnica de produção
de embriões in vitro em ovelhas na Costa
Rica
Natalia Soto-Barrientos
Universidad Nacional, Costa Rica
ROR:https://ror.org/01t466c14
Contacto: natalia.soto.barrientos@una.ac.cr
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1540-0563
Marcela Suárez-Esquivel
Universidad Nacional, Costa Rica
ROR:https://ror.org/01t466c14
Contacto:marcela.suarez.esquivel@una.ac.cr
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9174-2656
Laura Castro-Ramírez
Universidad Nacional, Costa Rica
ROR:https://ror.org/01t466c14
Contacto:laura.castro.ramirez@una.ac.cr
ORCID: https://orcid.org/0009-0004-4635-336X
Recibido 04-02-2025
Revisado 12-04-2025
Aceptado 17-09-2025
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Soto, N. Suarez, M. Castro L. Implementación de la técnica de
producción de embriones in vitro en ovinos en Costa Rica.
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Resumen
El departamento de Reproducción Animal de la Escuela de Medicina
Veterinaria de la Universidad Nacional de Costa Rica implementó la técnica de
producción de embriones ovinos in vitro. Se colectaron 341 óvulos a partir de
63 ovarios obtenidos de planta de cosecha y transportados al laboratorio en
durante la hora posterior al sacrificio. Los folículos fueron aspirados en tubos
con medio de colecta de óvulos (OPU, Bioscience®) y los óvulos con al menos
una capa completa de células del cúmulus (216/341) fueron colocados en
medio de maduración (IVM, Bioscience®) e incubados a 38.8°C por 22-24 h,
en atmósfera húmeda y CO2 al 5%. El 91.20% (197/216) de los óvulos
madurados con buena expansión del cúmulus y citoplasma homogéneo, fueron
fecundados con 1-2 x10
6
/ml de semen en medio de fertilización (IVF,
Bioscience®) por 16-22 h. Seguidamente, los cigotos fueron desnudados,
transferidos a medio de cultivo (IVC, Bioscience®), e incubados en una
atmósfera con baja presión de oxígeno. Después de 24 h de cultivo, la tasa de
división celular (clivaje) fue 57.36% (113/197). A los 7 días de cultivo la tasa
de blastocistos fue 20.81% (41/197) en relación con los óvulos con adecuada
maduración y 36.28% (41/113) en relación de los óvulos fecundados (clivaje).
Este estudio es un primer paso crucial hacia la producción de embriones ovinos
en Costa Rica, y abre nuevas oportunidades para potenciar la mejora genética
y productiva de pequeños rumiantes. Además, fortalece la formación
académica y el desarrollo de investigaciones estratégicas para solventar
necesidades prioritarias del sector agropecuario nacional.
Palabras clave: ovino, óvulo, embriones, blastocistos, in vitro
Abstract
In this study, the ovine embryo production technique with in vitro fertilization
was implemented in the Animal Reproduction Department of the Veterinary
Medicine School, Universidad Nacional, Costa Rica (UNA). A total of 63 ovaries
were collected from slaughterhouse’s ovaries, which were transported within
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one hour to the Veterinary Medicine school. The follicles were aspirated by
using oocyte collection medium (OPU, Bioscience®), and oocytes surrounded
by at least one complete layer of cumulus cells were selected (216/341), placed
in maturation medium (IVM, Bioscience®) and incubated at 38.8°C during 22
to 24 h, in a humid atmosphere with 5% CO2. The 91.2% (197/216) of the
matured oocytes that showed good cumulus expansion and homogeneous
cytoplasm, were fertilized with 1-2 x10
6
/ml semen in fertilization media (IVF,
Bioscience® during 16-22 h. The zygotes were denuded and transferred to
culture medium (IVC Bioscience®) and a low oxygen atmosphere. After a 24
h culture, the cleavage rate was 57.36% (113/197). After 7 days of culture,
the blastocysts rate was 20.81% (41/197) in relationship to the matured
oocytes, and 36.28% (41/113) according to the cleaved zygotes.
Our results are a first step towards the application of sheep in vitro embryo
production in Costa Rica. Its importance lies on its potential to promote genetic
and productive enhancement in small ruminants but also contributes to
educational and training purposes that bring new research opportunities aimed
to solve local needs.
Key words: ovine, oocyte, embryos, blastocysts, in vitro
Resumo
O Departamento de Reprodução Animal da Escola de Medicina Veterinária da
Universidade Nacional da Costa Rica implementou a técnica de produção de
embriões ovinos in vitro. Foram coletados 341 óvulos a partir de 63 ovários
obtidos em um matadouro e transportados ao laboratório dentro de uma hora
após o abate. Os folículos foram aspirados em tubos contendo meio de coleta
de óvulos (OPU, Bioscience®) e os óvulos com pelo menos uma camada
completa de células do cúmulo (216/341) foram colocados em meio de
maturação (IVM, Bioscience®) e incubados a 38,8°C por 22 a 24 horas, em
atmosfera úmida com 5% de CO₂.Do total, 91,20% (197/216) dos óvulos
maturados, que apresentaram boa expansão do cúmulo e citoplasma
homogêneo, foram fecundados com 1–2 x10⁶/ml de sêmen em meio de
fertilização (IVF, Bioscience®) por 16 a 22 horas. Em seguida, os zigotos foram
desnudos, transferidos para meio de
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cultivo (IVC, Bioscience®) e incubados em uma atmosfera com baixa pressão
de oxigênio.Após 24 horas de cultivo, a taxa de divisão celular (clivagem) foi
de 57,36% (113/197). Após sete dias de cultivo, a taxa de blastocistos foi de
20,81% (41/197) em relação aos óvulos com maturação adequada e de 36,28%
(41/113) em relação aos óvulos fecundados (clivados).Este estudo representa
um passo crucial para a produção de embriões ovinos na Costa Rica e abre
novas oportunidades para impulsionar a melhoria genética e produtiva de
pequenos ruminantes. Além disso, fortalece a formação acadêmica e o
desenvolvimento de pesquisas estratégicas voltadas para atender às
necessidades prioritárias do setor agropecuário nacional.
Palavras-chave: ovino, óvulo, embriões, blastocistos, in vitro
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producción de embriones in vitro en ovinos en Costa Rica.
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Introducción
El VI Censo Nacional Agropecuario, 2014, estimó la distribución de la población
de pequeños rumiantes en Costa Rica en 1 792 fincas con 35 800 ovinos y 2
348 fincas con 12 852 caprinos (INEC, 2015), evidenciando un crecimiento
importante del sector en comparación con el censo previo del 2006 (Maroto et
al., 2011). Sin embargo, como consecuencia de las regulaciones sanitarias
impuestas a la importación de material genético en Costa Rica, la mejora
genética de esta población fue limitada durante varios años, lo que ha resultado
en individuos pequeños y poco productivos. A raíz del crecimiento del sector y
de la presión de los productores, las autoridades competentes facilitaron la
apertura y la aprobación de protocolos que permiten la importación de semen
y embriones de pequeños rumiantes provenientes de varios países (SENASA,
2017).
La habilitación legal de importación de material genético de animales
genéticamente superiores abrió la posibilidad de implementar técnicas de
reproducción asistida (TRA), que potencian las tasas de éxito y la posibilidad
de obtener mayor número de individuos y más productivos. Las TRA presentan
ventajas tales como: (i) poder reproducir individuos que por diversas razones
ya no pueden ser reproducidos naturalmente, (ii) reducir el intervalo
generacional y (iii) obtener un mayor número de hijos de hembras de alta
calidad genética a un menor costo (Naitana y Ledda, 2020).
Algunas razas ovinas, incluso en condiciones tropicales, presentan patrones de
reproducción estacionales (Arroyo, 2011). En este contexto, las TRA se han
convertido en una herramienta clave para superar estas limitaciones y
potenciar el mejoramiento genético. Estas técnicas permiten su aplicación en
hembras seniles, prepúberes y preñadas, además de que la colecta de óvulos
puede realizarse inclusive sin necesidad de hormonas externas (Souza-Fabjan
et al., 2021). Esto ha generado un creciente interés en la implementación de
la producción in vitro de embriones (PIVE) y su criopreservación (Paramio &
Izquierdo, 2014). Después de la inseminación artificial, estas han demostrado
tener el mayor impacto en los programas reproductivos y de mejoramiento
genético a nivel mundial (Souza-Fabjan et al., 2014).
En comparación con los bovinos, la innovación e implementación de
tecnologías de reproducción asistida en pequeños rumiantes ha sido más
limitada. No obstante, investigaciones realizadas en torno a estos animales
han destacado su importancia en el desarrollo económico acelerado de países
asiáticos y su creciente uso, especialmente en cabras, como modelos para la
producción de proteínas recombinantes en la leche (Paramio & Izquierdo,
2016).
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Lamentablemente, los precios de las pajillas de semen son elevados y ciertos
procedimientos, como la transferencia de embriones y la recuperación de
óvulos para fertilización in vitro, requieren el uso de equipo laparoscópico, lo
cual no solo implica costos más elevados en materiales, sino contar con
personal capacitado para la manipulación apropiada de los animales y el
equipo. Por ende, si bien se ha dado la apertura para la importación de material
genético, su elevado costo económico no ha facilitado el avance genético
deseado.
En consecuencia, a través de este estudio, la Escuela de Medicina Veterinaria
(EMV) de la Universidad Nacional de Costa Rica implementó la técnica de PIVE
en pequeños rumiantes, iniciando con ovinos como modelo experimental, con
el fin de colaborar con el sector productivo, fomentar los procesos académicos
vinculados con estas especies, servir como entidad de apoyo a productores y
médicos veterinarios, y abrir un nicho que potencie la mejora genética de los
animales de este sector productivo en nuestro país.
Metodología
Para el estudio, se utilizaron ovarios de ovejas prepúberes provenientes de
plantas de cosecha. Los animales pertenecían a distintas razas, incluyendo
White Dorper, Katahdin, Hampshire y diversos cruces. Los ovarios fueron
extraídos post-mortem y transportados en solución salina a temperatura
ambiente (24-28°C) al laboratorio de Fertilización in vitro de la Escuela de
Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional dentro de la primera hora
posterior a la colecta.
Los protocolos de fertilización in vitro se pueden resumir en procesos
principales, que están acordes en cuanto a etapas y duración con el que es
utilizado por Hansen et al. (2023), Figura 1.
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Figura 1. Etapas del protocolo de producción de embriones in vitro a partir de
la aspiración de óvulos. Fuente: elaboración propia. Fuente: elaboración
propia.
En el laboratorio, los óvulos se recuperaron mediante aspiración con presiones
que oscilaron entre 50 y 80 mmHg y con un pequeño volumen de medio de
colecta OPU (Bioscience®) en el tubo recolector. Una vez colectado el fluido,
se procedió a revisarlo al estereoscopio para aspirar los óvulos, los cuales se
lavaron con el medio de lavado Wash (Bioscience®) y se seleccionaron de
acuerdo con la cantidad de células del cúmulus rodeando al óvulo,
considerando que al menos tuvieran una capa externa completa y citoplasma
homogéneo para ser considerados viables (Souza-Fabjan et al., 2016).
Los óvulos seleccionados se colocaron en platos de Petri con gotas de medio
de maduración IVM (Bioscience®), cubiertas con aceite (Sage®). Luego, se
incubaron (Steri-cycle i160, Thermo Scientific®) durante 22-24 horas bajo
condiciones controladas de humedad (> 93%), 5% de CO
2
y 38.8°C de
temperatura.
A las 24 h solamente los óvulos cuyo cúmulo presentó una expansión
correspondiente a al menos el doble de la del óvulo fueron considerados como
maduros (Mondal et al., 2019), junto con un citoplasma homogéneo, fueron
transferidos a gotas de medio de fertilización IVF (Bioscience®). Previo a la
fertilización, se descongeló una pajilla de semen de un macho Katahdin, con
morfología normal del 90%, vigor 5 y una motilidad post descongelamiento de
75%. Los espermatozoides se prepararon mediante gradientes de densidades
de 80% y 40% (PureCeption
TM
, Sage®) y se lavaron con medio Sperm Talp
(Bioscience®).
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En cada gota de IVF se colocaron de 20 a 25 óvulos y una concentración de
semen 1-2x10
6
/ml de espermatozoides. Se verificó en el borde de cada gota
que los espermatozoides presentaran motilidad progresiva y concentración
óptima. El cocultivo de los óvulos con los espermatozoides se mantuvo por 16-
20h, bajo condiciones de humedad, 5% de CO2 y a 38.8°C de temperatura.
Tras la fertilización, los cigotos fueron lavados y desnudados de las células del
cúmulus mediante pipeteo con una pipeta Stripper de 200 µm de diámetro.
Posteriormente, se transfirieron a gotas con medio de cultivo IVC
(Bioscience®), cubiertas con aceite y fueron incubados durante 7 días bajo
condiciones controladas de humedad, 5% de CO2, 5% de O2 y a 38.8°C de
temperatura. Las gotas fueron suplementadas con medio nuevo cada 48
horas. En el día 7 se realizó la revisión y conteo de los blastocistos presentes.
Resultados y discusión
En este estudio se aspiraron los folículos de un total de 63 ovarios recolectados
de ovejas prepúberes. Se obtuvo un total de 341 óvulos, con un promedio de
5.41 óvulos por ovario, de los cuales 216 fueron considerados viables. Estos
fueron utilizados en los ensayos de fertilización in vitro.
Después de 22-24 horas de cultivo en medio de maduración, se obtuvo un
porcentaje de óvulos con expansión adecuada del cúmulus y citoplasma
homogéneo del 91.2% (197/216).
Tras 16-22 horas de cocultivo con espermatozoides, se determinó una tasa de
clivaje de 57.36% (113/197) de los ovocitos con maduración adecuada del total
de óvulos fecundados. Finalmente, pasados 7 días de cultivo, se determinó
una tasa de obtención de blastocistos de 20.81% (41/197) de los óvulos
madurados, que corresponde a un 36.28% (41/113) de los cigotos que
presentaron clivaje. El detalle de los resultados se indica en la Tabla 1.
Tabla 1: Detalle de los resultados de la obtención de óvulos a partir de ovarios
colectados en plantas de cosecha de ovejas. Fuente: elaboración propia.
Tipo de estructura
Cantidad
Ovarios aspirados
63
Óvulos totales colectados
341
Óvulos aspirados por ovario
5.41
Óvulos viables seleccionados para maduración
216
Óvulos con buena maduración seleccionados para
fecundación
197
En términos generales, se reporta que entre el 70% y 90% de los óvulos
inmaduros logran alcanzar la metafase II en condiciones de maduración in vitro
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(Souza Fabjan et al., 2021), lo que concuerda con el porcentaje obtenido en
este estudio (91.20%). Ahora bien, es importante tener presente que cuando
se trabaja con óvulos de matadero en comparación con óvulos procedentes de
hembras adultas, colectados por laparoscopía (LOPU), las tasas de clivaje y de
blastocistos tienden a ser inferiores, muy variables e inconstantes (Souza
Fabjan et al. 2014). Los óvulos colectados de ovarios de matadero suelen
provenir de hembras prepúberes de diferentes razas, que suele resultar en
óvulos con menor competencia para madurar y ser fecundados, dado que es
más factible que provengan de folículos inmaduros en diferentes estados de
desarrollo (Leoni et al., 2015). En mamíferos, la competencia de los óvulos
para poder reanudar adecuadamente la maduración meiótica suele ir de la
mano con el crecimiento de los folículos (Mermillod et al., 2008). Los óvulos
maduros, además de contar con la capacidad de alcanzar la metafase II, deben
haber sufrido procesos citoplásmicos que se asocian con su capacidad de
sobrellevar adecuadamente los procesos vinculados con la fecundación, así
como la expansión y eventual pérdida de las células del cúmulus (Sen &
Caiazza, 2013). En consecuencia, los resultados de la maduración in vitro
dependen en gran medida de que las condiciones de cultivo simulen de mejor
manera el desarrollo folicular hasta la ovulación (Souza Fabjan et al., 2014),
situación que aún no se logra en su totalidad, por lo que su capacidad de
maduración es menor a la de oocitos obtenidos in vivo (Khatun et al., 2011).
No obstante, la utilización de este tipo de material, además de ser barato, es
esencial para poder establecer y estandarizar la técnica, pues permite reducir
la utilización de animales en producción, máxime que la obtención in vivo de
óvulos en ovinos implica la realización de procedimientos quirúrgicos o
laparoscópicos, reduciendo además la capacidad de repetición del proceso para
efectos experimentales (Teixeira et al., 2011). Otro factor importante, es que
actualmente se está trabajando en perfeccionar la técnica de cultivo de óvulos
de hembras prepúberes, debido al enorme potencial de reducción del intervalo
generacional que esto conlleva, maximizando la dispersión genética de
hembras de calidad superior (Izquierdo et al., 2019).
Sumado a lo anterior, el detalle del clivaje y la producción de embriones ovinos
se muestra en la Tabla 2.
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Tabla 2: Porcentajes obtenidos en los ensayos de producción de embriones in
vitro en ovinos a partir de ovarios recolectados en plantas de cosecha
de hembras prepúberes. Fuente: elaboración propia.
Tipo de estructura
Relación
Porcentaje
Maduración de óvulos
197/216
91.20
Clivaje a partir de los óvulos con buena maduración
113/197
57.36
Blastocistos obtenidos a partir de los óvulos con buena
maduración
41/197
20.81
Blastocistos a partir de los óvulos fecundados (clivaje)
41/113
36.28
En pequeños rumiantes se reportan tasas de clivaje promedio entre 50% y
80% (Souza Fabjan et al., 2021). Los valores obtenidos en nuestro estudio
(57.36%) se enmarcan en ese rango, que también está acorde con el de otros
estudios, como el de Mishra et al. (2016), que documenta valores entre
38.58% y 67%. La tasa de clivaje es importante porque refleja no solamente
la cantidad óvulos fecundados, sino que es un fuerte indicador de la calidad
del embrión y, por tanto, es un criterio adicional en la selección de embriones
para transferencia con el fin de aumentar las tasas de gestación (Fu et al.,
2009).
Sumado a lo anterior, en términos generales se reportan tasas de obtención
de blastocistos a partir de ovocitos de hembras adultas entre 25% y 50%,
tanto en cabras como en ovejas (Souza Fabjan et al., 2021). En este estudio
las tasas de obtención de blastocistos fueron de 20.81% en relación con los
óvulos maduros, y de 36.28% en relación con los cigotos que presentaron
clivaje. Nuevamente, es preciso tener presente que en nuestro estudio usamos
óvulos de hembras prepúberes, además, diversos autores reportan tasas de
clivaje similares utilizando óvulos de plantas de cosecha, entre 21 a 30.8% de
los óvulos madurados in vitro (Shabanrareh y Zandi, 2010; Cocero et al.,
2011). Respecto a las tasas de obtención de blastocistos en relación con las
estructuras que presentaron clivaje, partiendo de ovarios colectados en plantas
de cosecha, diversos autores reportan valores similares a los nuestros, tales
como Shabankareh et al. (2012) que reporta valores entre 16 y 45%.
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Conclusiones
Es evidente que se requiere un mayor esfuerzo para optimizar el rendimiento
de la técnica, ya que aún enfrentamos factores que han limitado su difusión a
gran escala. Entre ellos, la variabilidad en la calidad y cantidad de los óvulos
colectados, lo que genera inconsistencias en los resultados reportados por
distintos laboratorios. No obstante, la implementación y estandarización de
esta técnica es fundamental, ya que abre un abanico de oportunidades para
potenciar el mejoramiento genético en esta especie dentro del país.
En este sentido, este proyecto representa un primer paso en la producción de
embriones in vitro en pequeños rumiantes en Costa Rica, contribuyendo al
crecimiento del sector, así como la mejora de la calidad genética y la
productividad. Asimismo, refuerza el compromiso de la institución con el
desarrollo de investigaciones adaptadas a nuestras condiciones y la formación
de profesionales en esta área.
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